Proteínas II (Diálisis)

Diálisis:

La diálisis se emplea cuando hay un fallo renal, es decir que los riñones no pueden cumplir su función correctamente, lo cual significa que al filtrar la sangre, no solo se va hacia la orina los productos de desecho sino que también las proteínas.
En la experiencia utilizamos un dializador "casero" para demostrar que las proteínas no atravesaban la membrana del dializador. De ésta manera se puede concentrar un producto o separarlo de una mezcla de moléculas. Es necesario realizar éste paso a baja temperatura y en agitación constante, ya que la diálisis es un proceso molecular que depende exclusivamente de los movimientos aleatorios de las moléculas individuales. 


MATERIALES: 
Dializador (gomita elástica, papel celofán , botella cortada)
Vaso de Bohemia


SUSTANCIAS:
Proteínas( ovoalbúmina)
NaCl
H2O
AgNO3
CuSO4
NaOH

CLORURO DE PLATA:
El cloruro de plata es un compuesto químico de fórmula AgCl. Este sólido cristalino es bien conocido por su baja solubilidad en agua.El cloruro de plata es un sólido  blanco, y es su formación lo que determina que el ensayo sea positivo o negativo.
En agua,  el nitrato de plata (AgNO3) se disocia de tal manera:

AgNO3------ Ag+    +    NO3-

Ag+    +     Cl-  ---------AgCl(color blanco) (cloruro de plata)


ENSAYO DE BIURET:
Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta.


PROCEDIMIENTO:
1) Colocar dentro de un dializador una solución con ovoalbumina y NaCl.
2) Sumergir en un vaso de Bohemia con agua destilada( sin ningún desecho)
3)Tomar muestras de ambas partes del dializador,luego de un tiempo prudencial..
4) Agregar AgNO3 y ensayo de Biuret a ambas muestras.


CONCLUSIONES:

	BIURET	AgNO3
Interior	SI	Si
Exterior	No	Si

Muestras del exterior
Izq.:AgNO3 Der.:Biuret

AgNO3:
Podemos observar que tanto en la muestra del interior del dializador tanto como la del exterior del mismo, al agregarles AgNO3 las muestras toman un color blanco. Esto muestra que en ambas muestras hay una presencia de Cl( por lo que ya explicamos anteriormente), indicando que, el dializador deja pasar a los "desechos", ya que anteriormente solo se encontraba agua destilada.

Biuret positivo

Ensayo de Biuret:
Observamos que la muestra que tomamos del interior del dializador da positivo, lo que muestra que hay una presencia de ovoalbúmina, mientras que en el exterior da negativo. Esto comprueba que el dializador cumplió su función(no permitir que las proteínas traspasen la membrana).

Proteínas I

El objetivo de esta experiencia  trata sobre determinar la naturaleza de distintas proteínas en sus respectivos ensayos. Para hacerlo, se utilizaron dos reactivos, Biuret y Xantoproteica y cinco muestras: caseína, gelatina, ovoalbúmina , aspartamo y glicina.

MATERIALES:                                                        
Vaso de Bohemia                                                    
Varilla de vidrio                                                        
Mechero                                                                   
Soporte                                                                     
Tela metálica                                                            
Gradilla                                                                      
Tubos de ensayo                                                      
Papel absorbente                                                    
                                                                                 
SUSTANCIAS:
Leche descremada en polvo (caseína)
Gelatina
Clara de huevo (ovoalbúmina)
Edulcorante (aspartamo)
Glicina
NaOH
HNO3
CuSO4
C2H4O2

FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA:

El reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida. El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas. En este caso si el reactivo pasa a color violeta es positivo y si queda azul es negativo.
Un resultado negativo de la reacción del biuret sobre una muestra problema no necesariamente indica la ausencia de proteínas, ya que puede suceder que :
*no existan proteínas o péptidos en la muestra
*existan otras sustancias que impidan que se produzca la reacción.
Para poder llevar a cabo el ensayo de Biuret, se debe agregar sobre la muestra 1 mL( 20 gotas) de CuSO4 y además 3 gotas de NaOH.

(Compuesto amarillo)

Por otra parte, la reacción xantoproteica es un método que se puede utilizar para determinar la cantidad de proteína soluble en una solución, empleando ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba no torna de color amarillo oscuro es negativa. La adición de base fuerte hace que el color se torne más oscuro hacia anaranjado. Para poder lograr la reacción xantoproteica se debe agregar sobre la muestra 10 gotas de HNO3 concentrado.



Caseína: 

La caseína es una fosfoproteína (un tipo de heteroproteína) presente en la leche y en algunos de sus derivados .Es una proteína de carácter ácido debido a su elevada proporción de aminoácidos ácidos (PI=4,6). Todas las proteínas englobadas en lo que se denomina caseína tienen una característica común: precipitan cuando se acidifica la leche a pH 4,6. Por ello, a la caseína también se le suele denominar proteína insoluble de la leche.

Procedimiento:
1)- Colocar leche en polvo y agua en vaso de Bohemia.
2)- Agitar hasta homogeneizar.
3)-Calentar hasta aproximadamente 40ºC, agitando con la varilla de vidrio
4)-Retirar del fuego
5)-Agregar acido etanoico gota a gota hasta la coagulación de la caseína
6)- Separar los coagulos de caseína, del suero
7)-Secarlos con papel absorbente
8)- Separar dos porciones del sólido en dos tubos de ensayo.

(Xantoproteica) 

(Biuret) 

Conclusiones:
La caseína en el ensayo de Biuret da positivo (color violáceo)  luego de haber agregado sobre la muestra 1 mL( 20 gotas) de CuSO4 y además 3 gotas de NaOH, ya que posee por lo menos dos enlaces peptídicos.
La caseína en la reacción xantoproteica da positivo también (color amarillento) luego de haberle agregado sobre la muestra 10 gotas de HNO3 concentrado, ya que posee tirosina o triptófano en la caseína. 
                                                                               

                                                                                                        
Gelatina:

La gelatina es una proteína compleja, es decir, un polímero compuesto por aminoácidos. Como sucede con los polisacáridos, el grado de polimerización, la naturaleza de los monómeros y la secuencia en la cadena proteica determinan sus propiedades generales. Una notable propiedad de las disoluciones de esta molécula es su comportamiento frente a temperaturas diferentes: son líquidas en agua caliente y se solidifican en agua fría.Al ser proteína en estado puro, ésa es su mayor propiedad nutritiva: proteína (84-90%), sales minerales (1-2%) y agua (el resto).

Procedimiento:
1)-Preparar la gelatina
2)-Separar en 2 tubos de ensayo.

(izquierda xantoproteica, derecha Biuret)

Conclusiones:
Luego de hacer las pertinentes reacciones , se puede concluir que la gelatina dio positivo frente al ensayo de Biuret, ya que presenta al menos 2 enlaces peptidicos, y negativo en la reaccion xantoproteica ya que presenta un color incoloro, esto se debe a que la gelatina prácticamente carece triptófano ya que el poco que existía se suele destruir en su preparación.

                                                                                                 
Ovoalbúmina: 

La ovoalbúmina es la principal proteína de la clara del huevo (60-65% del peso de la clara de huevo). Pertenece a la superfamilia proteínica de las serpinas, aunque a diferencia de la mayoría de éstas la ovoalbúmina no es capaz de inhibir cualquier peptidasa.Es llamada fosfoglucoproteína integrada por tres fracciones, A1, A2 y A3, en una proporción de 85:12:3, respectivamente, que se diferencian por su contenido en fósforo. Es rica en cisteína y metionina y presenta grupos sulfhidrilos.

Procedimiento:
1)- Cascar el huevo y separar la clara de la yema
2)-Colocar la clara en agua en un vaso de Bohemia
3)-Homogeneizar lo mas posible con varilla de vidrio
4)-Separar la solución en 2 tubos de ensayo


Conclusiones:
Luego de hacer los respectivas reacciones ya mencionadas, concluímos que la ovoalbúmina da positivo bajo el ensayo de Biuret debido a su color violáceo. Esto se debe a que por lo menos presenta 2 enlaces peptídicos. Bajo la reacción xantoproteica, la muestra toma un color violáceo, lo que nos identifica que da positivo frente a dicha reacción, y esto se debe a la presencia de tirosina o triptófano en la ovoalbúmina.



Aspartamo:

El aspartamo es un edulcorante bajo en calorías. Es un 
dipéptido que contiene dos aminoácidos, ácido aspártico y fenilalanina, dos de 
los componentes de las proteínas.
Los aminoácidos presentes en el aspartamo se encuentran de forma natural en 
la mayoría de los alimentos ricos en proteínas, como las carnes, los productos lácteos y las verduras.

Procedimiento:
1)-Colocar con la punta de una cuchara aspartamo en 2 tubos de ensayo
2)-Agregar agua en los 2 tubos

Conclusiones:
Una vez realizado el ensayo de biuret, la solución no resulta de color violeta por lo tanto, la reacción da negativa y deducimos que el aspartamo no presenta enlaces peptidicos.
Después de realizado el ensayo xantoproteico , la solucion resulta incolora por ende, la reaccion da negativa y deducimos que el aspartamo no presenta tirosina o triptófano.


Glicina:

La glicina o glicocola (Gly, G) es uno de los aminoácidos que forman las proteínas de los seres vivos.Es el aminoácido más pequeño y el único no quiral de los 20 aminoácidos presentes en la célula.La glicina no es esencial en la dieta humana, ya que el propio cuerpo se encarga de sintetizarla. Todas las células tienen 

capacidad de sintetizar glicina. Hay dos vías para sintetizarla: la fosforilada y la no-fosforilada. El precursor más importante es la serina. La fosfoserina fosfatasa, desfosforila a la fosfoserina hasta serina. La enzima serina hidroximetil transferasa da lugar a la glicina a partir de la serina. La glicina usada como neurotransmisor es almacenada en vesículas, y es expulsada como respuesta a sustancias.

Procedimiento:
1) Colocar una punta de espatula en dos tubos de ensayo
2) Agregar un poco de agua

Conclusiones:
Luego de realizado el ensayo, la solución resulta por lo tanto, la reacción da negativa y deducimos que el aspartamo no presenta enlaces peptidicos.Una vez realizado el ensayo, la solución resulta incolora por ende, la reacción da negativa y deducimos que el aspartamo no presenta tirosina o triptófano.

Muestra	Biuret	Xantoproteica
Caseína	+	+
Gelatina	+	-
Ovoalbúmina	+	+
Aspartamo	-	-
Glicina	-	-